Kategori: Experiment

Publicerad den av — Lämna en kommentar

Serie: Vägen till den klonade bakterien #2

När jag lämnade av vid förra inlägget hade jag försökt odla upp bakterier från den tub vi hade fått. Jag hade odlat upp en tub till tio tuber och droppat på några droppar på en agarplatta för att se om det verkligen hade växt, även om det visuellt såg ut som att det hade växt bra. Plattan låg i en inkubator på 37 °C i ett par dagar. Jag förväntade mig att det skulle växa rejält eftersom det var ganska många droppar. Men till min förvåning hade bara en koloniväxt. Trots detta försökte jag mig på att göra en transformation med dessa celler. Protokollet för att göra en transformation i en amatörlabb är inte helt okomplicerat. För att bakterier ska plocka upp främmande DNA måste man behandla dem kemiskt för att försvaga deras cellväggar (göra dem kompetenta). Det finns olika sätt att göra det på, och den bästa metoden kan bara göras på företag eller universiteten eftersom man behöver viss utrustning och material som inte är lätt-tillgängligt. De enklare metoderna är inte lika effektiva men vi har använda kalciumklorid (CaCl₂)-metoden som funkade bra för oss för några år sedan.

Med kalciumklorid-metoden odlar man upp bakterier och låter dem sedan vila i 0.05 – 0.1 M CaCl₂ i 10-20 minuter och sedan heat shockar man bakterierna. Tyvärr finns det inget protokoll för hur man gör detta som passar de förutsättningar som finns på biolabbet i Stockholm Makerspace, så jag har testat mig fram lite, tyvärr utan någon framgång. Senaste gången använde jag 50 µl bakterier och 150 µl 0.1 M CaCl₂ som fick vila i 10 minuter. Det resulterade inte i någon koloni på agarplattan. Det finns några möjliga felkällor:

  • Förhållandet mellan volymen bakterier och CaCl₂ är fel.
  • Blandningen mellan bakterier och CaCl₂ fick inte vila tillräckligt länge.
  • Kylningen av blandningen var inte tillräckligt effektiv.
  • Kylningen efter värmechocken var inte tillräckligt effektiv.
  • Det fanns för lite eller inga bakterier till att börja med.
  • Concentrationen 0.1 M CaCl₂ är för starkt och dödade bakterierna.

Själv tror jag mest på att det inte fanns tillräckligt med bakterier till att börja med, dels baserat på den plattan jag odlade innan, och där det bara hade växt en koloni, men också på att man kunde se att det inte hade växt nåt efter inkubationen efter värmechocken (inget borde ha dödat bakterierna innan dess och de borde ha växt så att det hade varit synligt med blotta ögat). Jag ska odla en till platta med bara bakterier för att dubbelbekräfta att det är för liten koncentration av bakterier.

Men jag tror även att den ineffektiva kylningen både innan och efter värmechocken kan ha spelat en roll, eftersom jag inte hade is för kyla, utan använde kylda metall block. Det ska åtgärdas genom att jag använder is nästa gång. Eventuellt är 0.1 M CaCl₂ för starkt, men tvivlar på det. Det blir en faktor att testa om det misslyckas nästa gång.

Tuber med förhoppningsvis uppodlade bakterier.
Publicerad den av — Lämna en kommentar

Serie: Vägen till den klonade bakterien #1

Det finns en grej jag velat göra en längre tid i biolabbet, och nu börjar jag få tid för det. Jag vill transformera (modifiera) enkla bakterier till att producera färger. Det finns två anledningar till detta. Det första är att om jag lyckas modifiera bakterier till att producera färger så har jag satt grunden för att kunna få bakterier att även göra andra enkla saker (producera dofter, enzymer och andra proteiner). Man kommer fortfarande vara beroende av att andra har lagt ned mycket av grundjobbet för att producera dessa saker på ett eller annat sätt. Men eftersom vi i biolabbet har tillgång till dessa färdiga beståndsdelar så är det bara processen att få in dessa beståndsdelar in i cellerna och få dem att producera dem som behöver utarbetas.

Den andra anledningen till att jag vill göra det här projektet är för att det kräver att jag utvecklar protokoll, metoder och processer som är självklara i professionella labbar, men som vi inte har jobbat fram på biolabbet i Stockholm Makerspace. Det i sin tur kommer leda till att vi kan göra andra typer av experiment.

Jag tänker att det vore en bra grej att dokumentera hela den här processen här på bloggen, dels för min egen del som en logg över vad jag gjort tidigare, men även för andra att få en insyn i arbetet som krävs för att göra en sådan grej som att modifiera bakterier till att producera färger. Jag kommer avstå från att skriva tekniska och svårlästa texter, och där jag behöver använda tekniska ord kommer jag förklara vad de betyder. Det blir inga detaljerade beskrivningar om varje experiment, utan mer en berättande text. Och det blir för första gången en serie av texter. Jag kommer skriva texter i denna serie med jämna mellanrum tills målet är uppnått.

Till att börja med behövs det såklart bakterier. Det finns en rad vanligt förekommande organismer som man jobbar med i biolabbar. Den organism jag kommer jobba med är en typ av E. coli som kallas för TOP10. Detta är en art av E. coli som modifierats på flera olika sätt [PDF] för att fungera speciellt bra för experiment när man vill jobba med så kallad kloning. Kloning innebär helt enkelt att man klipper och klistrar DNA, för in DNAt in i celler och kopierar upp dem.

OBS! För att vara tydlig, detta finns olika arter av E. coli-bakterier, varav vissa är farliga och orsakar till exempel matförgiftning, men denna art som jag kommer jobba med är inte en sådan farlig art.

Men redan här börjar problemen vad gäller material och metoder. I somras drog nämligen någon ut sladden till den frys där vi bevarade alla bakterier och de initiala testerna visade att bakterierna hade dött. Bara att utföra dessa tester tog ganska lång tid. Men igår fick vi tag i en eppendorf-tube med 1 mL TOP10-celler. Det är gott och väl mer än vad som behövs för att det aldrig ska ta slut. Jag har odlat upp dessa nu. En tub celler är nu över tio stycken nya tuber med celler. Jag tyckte att det visuellt gick att avgöra att cellerna hade växt, men för säkerhetsskulle strök jag även ut lite av cellerna på en agarplatta. Om det blir ett positivt resultat på agarplatta blir nästa steg att göra många tuber med celler, sådana så kallade working stocks (WS). En WS är helt enkelt en tub med celler (eller nåt annat) som man faktiskt använder i sina experiment, och sedan odlar man upp från orginal stocken när man behöver mer. Resultat borde komma inom de närmaste dagarna.

Agarplattor
Agarplattor är geler med näring som bakterier kan växa på. Agarplattor är ofta enkla att göra själv. I biolabbet på Stockhom Makerspace gör vi dem själva.
Publicerad den av — 1 kommentar

Vi skapade bakterier som lyser!

Dåså! Vi har länge pratat om det. Nu äntligen lyckades vi modifiera DNAt för E.coli-bakterier så att bakterierna började lysa!

Vi sa för flera månader sen att vi skulle göra det här experimentet i samarbete med iGEM Stockholm under en workshop. Denna workshop höll vi i söndags förrförra veckan (16e oktober). Tyvärr lyckades vi inte få några lysande bakterier då. Men i söndags förra veckan (23e oktober) var vi ett litet gäng nere på Makerspace för att försöka igen. Jag såg ganska direkt vad vi hade gjort för fel första gången. Bakterierna från orginalprovet hade klumpat sig i botten av Eppendorf-tuben så vi hade troligen inte fått med några bakterier alls första gången. Vi gav bakterierna även längre tid på sig att uttrycka antibiotika-resistenta genen. Det löste problemet och nedan kan man se resultatet av de lysande bakterierna.

14720509_10211208214631366_7865233755866036062_n

Om man själv vill testa på att modifiera bakterier så kommer vi köra denna workshop igen nästa månad. Håll ögon och öron öppna på Facebook.

Publicerad den av — 1 kommentar

Genombrott i labbet!

Sen biohackingkonferensen har jag samlat en grupp personer som visat extra mycket intresse för labbet och vi träffas med jämna mellanrum och försöker kickstarta verksamheten i labbet. Första gången vi träffades för att labba på riktigt var på Kristihimmelsfärdsdagen då vi försökte genomföra hela processen med att analysera DNA med PCR-tekniken. Målet var att testa om utrustningen fungerade. För att göra detta bestämde vi oss för att strunta i de första stegen med att designa primers och extrahera DNA. Jag bad en kontakt på Stockholms universitet om vi kunde få lite bakterie-DNA och primers och det var inga problem. Vi fick lite leftover plasmider med tillhörande primers. Vi satte igång med att använda PCR-maskinen för att kopiera upp plasmiderna. Vi kom till sista steget som är elektroforessteget innan jag insåg att vi saknade den DNA-färg som krävs för att kunna genomföra det steget.

En jakt började för att få tag i denna typ av färg, som inte är helt lätt att få tag i om man är ett biohackerlabb i Sverige då priset är riktigt saftigt. Jag skrev upp Makerspace som kund på bioteknikföretaget VWR för de hade det billigaste priset. Den processen i sig tog nästan två veckor. Men precis innan jag skulle köpa in färgen kom jag i kontakt med en forskare på Örebro-universitet och efter lite diskussioner erbjöd han sig att skicka exakt den färgen vi behövde, och helt gratis för oss på Makerspace! Väldigt hyggligt! Jag måste säga att stödet vi har fått från enskilda forskare på svenska universitet har varit fantastiskt och helt ovärderligt.

2016-05-25 19.10.27

Paketet tog jag med mig (under kylning!) till Makerspace och vi träffades på nytt på nationaldagen för att fortsätta testet, bara för att inse att färgen vi hade fått inte var anpassat för vanlig PCR. Den var anpassad för det som kallas för RT-PCR, vilket jag visste från början. Det jag inte visste var att man använder olika koncentrationer av färgen för PCR respektive för RT-PCR. För RT-PCR används en 10x-koncentration och för PCR används en 10,000x-koncentration. Stor skillnad. Det hade inte gått att anpassa 10x-koncentrationen för vårt syfte genom att blanda det med gelen som man ofta gör. Men idén dök upp att blanda 10x-koncentrationen med proverna innan de sattes på gelen. Enligt instruktionerna skulle det funka att göra det på det sättet så vi bestämde oss för att testa den vägen. Vi mixade ihop allting och slängde upp (in?) proverna på gelen.

2016-06-06 12.28.47

Tjugo minuter senare kunde vi se resultatet på transilluminatorn. Det lyckades! Plasmiderna hade kopierats upp och proverna hade färgats trots att vi inte hade rätt koncentration. På bilden nedan är de ljusgröna kvadraten DNAt som kopierats upp. De med bra kunskaper och erfarenhet av PCR kan se att stegen till vänster inte har fått rätt upplösning och det är en grej vi får jobba på att lösa. Det viktiga just denna gång var att visa att PCR-maskinen fungerar och att SYBR Green (som färgen heter) fungerar med blått ljus. Vilket vi också gjorde. Som ett plus vet vi nu också att vi kan förfärga proverna innan de sätts på gelen.

2016-06-06 13.09.32

Slutsatserna av allt det här arbetet är att den grundläggande tekniken för att analysera DNA nu finns på Stockholm Makerspace och fungerar! Nästa steg blir att justera resultaten och få rätt upplösning på stegen. Parallellt måste vi hitta en metod för att extrahera DNA, designa primers och hitta någonstans att beställa från. Efter det kan vi börja jobba med andra organismers DNA.

Publicerad den av — Lämna en kommentar

Labbets status under våren

Under början av året gav jag ett löfte att satsa mer på biolabbet som finns på Stockholm Makerspace. Sedan dess har jag samlat ett par personer som visat stort intresse att driva projekt aktivt i labbet så att vi gemensamt kan jobba på att gå igång verksamheten i labbet. Målet är att få genomföra en PCR-analys. Vi har hittills träffats två gånger i labbet. Den första gången gick vi genom hur PCR funkar och vi listade ett par projekt som vi möjligen skulle kunna genomföra. Andra gången bestämde vi oss för att genomföra ett test av en gen som bestämmer om man kan känna av den bittra smaken som kallas för PTC och vi röjde undan mycket skräp som låg i labbet.

2016-04-13 21.51.35

Vi bestämde även att vi den 5e maj ska genomföra ett testförsök av utrustningen för att se om de funkar. För det testet kommer vi få plasmid-DNA och primers av en kontakt på Stockholms universitet. På det sättet slipper vi steget med att extrahera DNA. Då vet vi säkert att det åtminstone finns DNA i provet om det blir nåt problem med resultatet.

Så just nu pågår förberedelser inför 5e maj. DNA och plasmider ska hämtas från SU, protokollet för analysen ska färdigställas, skräp måste slängas, eventuellt måste en våg köpas in osv. Om man vill hjälpa till med att gå igång labbet kan man börja med att börja följa biolabbets Facebook-grupp som vi använder för att kommunicera på, eller så kan man kontakt mig för mer information.

Publicerad den av — Lämna en kommentar

And how is the lab going?

The lab is making a lot of progress! But it’s one step forward, two steps back. Every time I solve a problem three new arise.

I have at this moment managed to extract some DNA from myself (NaOH, boiling and Tris). I have used the openPCR to amplify the PTC gene and now I have to be able to run an gel electroforesis to be able to see the result. The problem is that the eletroforesis system I have is old and needs some fixing. I will take care of it as soon as I have the spares, but I have also ordered the IOrodeo electroforesis system just to be sure I have a working electroforesis system soon. And I will release the protocol ones I have made sure it works. Until the here is a picture of me boiling some DNA.

2015-10-22 13.31.37

Publicerad den av — Lämna en kommentar

Bionyfiken ställer upp i Stockholm Mini Maker Faire

Bionyfiken har blivit inbjudna till att ställa upp i Stockholm Mini Maker Faire 9-10 maj. Vi byggt labbet under hela våren och har inte kommit gång med våra experiment. De riktigt coola grejerna kommer vi visa upp under nästa års Stockholm Mini Maker Faire misstänker jag. I år kommer jag ta med några tDCS:er, lite hushållsprylar så vi kan extrahera vårt eget DNA och kanske en obyggd openPCR-maskin som eventuellt byggs ihop på plats om det finns tid. Självklart ställer massa andra spännande makers ut med riktigt roliga, häftiga och otroliga saker. Mer information finns här.

Publicerad den av — 4 kommentarer

Biohacking 101 – Extrahera DNA

Nu har jag gjort det första självexperimentet. Extraherade mitt eget DNA. Att extrahera DNA, sitt eget eller något annat som innehåller DNA, känns väldigt mycket som bioteknikens motsvarighet till programmerarnas ”Hello World”-test. Så om man ska börja någonstans så är det här.

Har letat runt på internet efter ett bra protokoll på hur man kan extrahera sitt eget DNA med enkla hushållsmedel men har inte hitta någon jag är helt nöjd med, och jag tycker dessutom att förklaringarna har varit för dåliga för varför man behöver varje enskild ”ingrediens” och hur mycket av varje grej som behövs. Men efter att ha kollat på alla självextraheringsguider jag kunnat hitta så jag kommit fram till följande protokoll. Jag ska utföra fler försök för jag vill öka utbytet så mycket som möjligt inför söndagens workshop. Ska också testa med frukt. Förhoppningsvis finns lite lite jordgubbar kvar i affärerna fortfarande.

Protokoll för extrahering av DNA från saliv

Vissa saker är inte helt lätta att få tag på men det finns alternativ som funkar lika bra. Jag har skrivit alternativen inom parentes och även var man kan köpa dessa.

Vad du behöver:

15 ml destillerat vatten (Batterivatten duger bra. Finns att köpa på Biltema)
15 ml etanol >64% (T-röd funkar lika bra. Finns att köpa på Biltema)
1 nypa vanligt hushållssalt
1 droppe diskmedel

Bra att ha men inget krav:
Mätglas – Det blir så mycket enklare att mäta upp 15 ml med mätglas än med något annat. Men det är inget krav. Om man vill ha labbutrustning kan man köpa det på nätet.

2014-08-30 20.23.18

Så här gör du:

1. Mät upp 15 ml batterivatten i mätglaset och häll över det i en annan behållare, till exempel ett mindre glas. Om du inte har ett mätglas häll upp ungefär en matsked vatten i ett glas.
2. Ta två nypor salt och häll ner det i glaset med batterivattnet. Rör om med en sked tills saltet löst upp sig.
3. Gurgla vattnet i 30 – 60 sekunder. Desto längre du gurglar vattnet desto mer DNA får du i slutändan. Det är också viktigt att du skrapar tänderna mot dina kinder för att få med så många celler som möjligt. Det kan vara så att det är viktigare att skrapa tänderna mot kinderna än att faktiskt gurgla runt vattnet i munnen.
4. Spotta ut vattnet i ditt glas igen. Desto grumligare vattnet är, desto fler celler har du lyckats skrapa av dina kinder och därmed desto mer DNA kommer du få i slutändan. Vattnet bör vara väldigt grumligt.
5. Häll i en droppe diskmedel i glasetoch rör om försiktigt så att det inte bildas bubblor.
6. Mät upp 15 ml eller ungefär en matsked av T-röd i ditt mätglas eller i en annan behållare.
7. Tippa glaset med vattnet och dina celler och häll försiktigt över T-röd över vattnet så att T-röden skiktar sig över vattnet.
8. Låt stå i 3-5 minuter. Efter en stund kommer du se vita strängar i alkohol-delen av ditt glas. Det är ditt DNA. Du kan peta upp det med en tandpetare eller något liknande.

Resultatet:

Här är resultatet. Här har jag petat upp mitt eget DNA.

dna

Varför behövs just dessa ”ingredienser”?

Destillerat vatten / Batterivatten: Jag har inte lyckats hitta någon förklaring till varför vattnet måste vara destillerat. Jag har testat lite med vanligt vatten, som verkar kunna funka lika bra men jag måste testa lite mer. Förklaringen jag kan tänka mig är att det dels är standard att använda destillerat vatten för vilka sorts experiment man än gör i ett professonellt labb och dels så behöver vattnet vara rent från bakterier så att man kan vara säker på att DNAt man får fram är från den organism man tagit ett prov av. Men inget av dessa anledningar är tillräckligt viktiga när man göra denna enkla experiment i sitt kök, så vanligt kranvatten bör fungera lika bra som destillerat vatten.

Salt: Att förklara mekanismen för saltet är lite för överkurs men saltet har en roll i att få DNAt utfällt. Enkelt förklarat interagerar saltet med det negativa DNAt vilket försvagar DNAts interaktion med vattenmolekylerna och därför kan DNAt fällas. Observera att det inte räcker med salt för att fälla ut DNAt. Man behöver även alkoholen.

Diskmedlet: Diskmedel löser upp fett. Fett är en typ av lipid. Cellers membran består av fosfolipider. Diskmedlet löser alltså upp cellmembranet och cellkärnans membran så att DNAt frigörs till vattnet.

Alkohol: Alkohol har lägre densitet än vatten. Det är därför lätt att skikta alkohol över vatten. Vatten är också mycket mer polärt än alkohol. Att vatten är starkt polärt innebär att DNA som är negativt gärna interagerar med de positiva polerna av vattet. I alkohol som inte är lika polärt som vatten kommer saltets natriumjoner enklare att interagera med DNAt och därför fälls DNAt ut i alkohol. Med tiden då allt mer DNA hamnar i alkohol skiktet så ser man allt mer utfällt DNA.

Frågor:
1. Måste man använda destillerat vatten/batterivatten? Varför?
2. Måste man tillsätta salt innan man gurglar?
3. Vissa protokoll säger att kall alkohol fungerar bättre än ljummen alkohol. Varför?
4. Hur länge är DNA hållbart i vatten?

Hur går man vidare?
Okej, nu när man kan få tag i sitt eget DNA, hur kan man gå vidare? Det jobbiga här är att DNAt man fått fram här är på tok för ”smutsigt” för att man ska kunna gå vidare med det och utföra analyser på det. I den där strängen i sista bilden så finns inte bara DNA, det finns även massa proteiner, RNA och annat ”cellskräp”. I professionella labbar renar man alltid DNAt från protein, RNA och annat skräp innan man slutligen förvarar DNAt i så kallad TE-buffer. Dessa reningsprocesser är lite mer komplicerade än att extrahera själva DNAt och det är nästa steg för mig att klura på hur man kan lösa utanför professionella labbar. Men eftersom det finns så många hobbyforskare så kan jag inte tänka mig att någon redan tagit fram ett protokoll för detta redan, så det borde inte vara svårt att hitta en lösning för hela extraherings- och reningsprocessen.