Publicerad Lämna en kommentar

Serie: Vägen till den klonade bakterien #2

När jag lämnade av vid förra inlägget hade jag försökt odla upp bakterier från den tub vi hade fått. Jag hade odlat upp en tub till tio tuber och droppat på några droppar på en agarplatta för att se om det verkligen hade växt, även om det visuellt såg ut som att det hade växt bra. Plattan låg i en inkubator på 37 °C i ett par dagar. Jag förväntade mig att det skulle växa rejält eftersom det var ganska många droppar. Men till min förvåning hade bara en koloniväxt. Trots detta försökte jag mig på att göra en transformation med dessa celler. Protokollet för att göra en transformation i en amatörlabb är inte helt okomplicerat. För att bakterier ska plocka upp främmande DNA måste man behandla dem kemiskt för att försvaga deras cellväggar (göra dem kompetenta). Det finns olika sätt att göra det på, och den bästa metoden kan bara göras på företag eller universiteten eftersom man behöver viss utrustning och material som inte är lätt-tillgängligt. De enklare metoderna är inte lika effektiva men vi har använda kalciumklorid (CaCl₂)-metoden som funkade bra för oss för några år sedan.

Med kalciumklorid-metoden odlar man upp bakterier och låter dem sedan vila i 0.05 – 0.1 M CaCl₂ i 10-20 minuter och sedan heat shockar man bakterierna. Tyvärr finns det inget protokoll för hur man gör detta som passar de förutsättningar som finns på biolabbet i Stockholm Makerspace, så jag har testat mig fram lite, tyvärr utan någon framgång. Senaste gången använde jag 50 µl bakterier och 150 µl 0.1 M CaCl₂ som fick vila i 10 minuter. Det resulterade inte i någon koloni på agarplattan. Det finns några möjliga felkällor:

  • Förhållandet mellan volymen bakterier och CaCl₂ är fel.
  • Blandningen mellan bakterier och CaCl₂ fick inte vila tillräckligt länge.
  • Kylningen av blandningen var inte tillräckligt effektiv.
  • Kylningen efter värmechocken var inte tillräckligt effektiv.
  • Det fanns för lite eller inga bakterier till att börja med.
  • Concentrationen 0.1 M CaCl₂ är för starkt och dödade bakterierna.

Själv tror jag mest på att det inte fanns tillräckligt med bakterier till att börja med, dels baserat på den plattan jag odlade innan, och där det bara hade växt en koloni, men också på att man kunde se att det inte hade växt nåt efter inkubationen efter värmechocken (inget borde ha dödat bakterierna innan dess och de borde ha växt så att det hade varit synligt med blotta ögat). Jag ska odla en till platta med bara bakterier för att dubbelbekräfta att det är för liten koncentration av bakterier.

Men jag tror även att den ineffektiva kylningen både innan och efter värmechocken kan ha spelat en roll, eftersom jag inte hade is för kyla, utan använde kylda metall block. Det ska åtgärdas genom att jag använder is nästa gång. Eventuellt är 0.1 M CaCl₂ för starkt, men tvivlar på det. Det blir en faktor att testa om det misslyckas nästa gång.

Tuber med förhoppningsvis uppodlade bakterier.
Lämna ett svar

E-postadressen publiceras inte. Obligatoriska fält är märkta *